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Thèses et Mémoire de l'Université de Strasbourg

Expression hétérologue de Récepteurs Couplés aux Protéines G dans la levure Pichia pastoris: une contribution au projet MePNet

CHEROUATI, Nadia (2005) Expression hétérologue de Récepteurs Couplés aux Protéines G dans la levure Pichia pastoris: une contribution au projet MePNet. Thèses de doctorat, Université Louis Pasteur.

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Résumé

La famille des Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) est la plus importante famille de récepteurs transmembranaires responsables de la transduction de signaux extracellulaires. Cette famille protéique représente l’une des plus importantes catégories de cibles thérapeutiques puisqu’elles sont la cible de près de 60% des médicaments actuels (Howard et al. 2001, TIPS 22:132-140). Une seule structure de RCPG a été décrite à ce jour, celle de la rhodopsine bovine (Palczewski et al. 2000, Science 289:739-745). Le travail présenté dans ce manuscrit est une contribution au projet de recherche européen MePNet (Membrane Protein Network) (Lundstrom K. 2004, Curr Opin Drug Dicscov Devel. 3 :342-346). Le but de ce projet de biologie structurale consiste à exprimer une centaine de protéines membranaires de la famille des RCPG dans trois systèmes d’expression différents (Escherichia coli, Pichia pastoris et cellules de mammifères infectés par le Virus de la Forêt de Semliki - SFV). Ce travail consiste à réaliser à chacune des étapes du progamme, l’étude d’un panel de plusieurs RCPG exprimés dans la levure Pichia pastoris tout en développant les méthodologies et les stratégies les plus adaptées aux contraintes du projet. Dans un premier temps afin de faciliter l’obtention des différents ADN nécessaires à la réalisation du projet, une approche systématique de clonage d’ADNc à partir de différentes sources d’ADN et d’ARN a été développée et validée. Par la suite, afin de réaliser une quantification fiable et reproductible des niveaux d’expression des RCPG chez Pichia pastoris une méthode d’imunodétection par dot-blot a spécifiquement été développée pour le projet. La fonctionnalité des récepteurs exprimés a ensuite été quantifiée par des tests de fixation de ligands à l’équilibre (ou test de « Binding »). Dans le but d’optimiser les résultats obtenus dans des conditions standard d’expression, des études mesurant l’effet de différents paramétres sur l’expression de récepteurs fonctionnels ont par la suite été réalisées. Préalablement aux étapes de purification, des tests de solubilisation ont été conduits pour sélectionner parmi un panel de 15 détergents les conditions permettant d’obtenir un bon rendement de solubilisation tout en conservant la fonctionnalité des récepteurs solubilisés. Des études de purification par chromatographie d’affinité ont finalement été réalisées sur deux récepteurs. Les résultats prometteurs obtenus pourront certainement être améliorés par un certain nombre d’optimisations préparatives et analytiques.

Type d'EPrint:Thèse de doctorat
Sujets:CL Classification > DDC Dewey Decimal Classification > 500 Sciences de la nature et mathématiques > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 572 Biochimie > 572.6 Protéines
Classification Thèses Unistra > Santé > Sciences de la vie, biologie, biochimie > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 572 Biochimie > 572.6 Protéines

UNERA Classification UNERA > DISC Discipline UNERA > DISC-16 Sciences de la vie et de la santé, psychologie
UNERA Classification UNERA > ACT Domaine d'activité UNERA > ACT-2 Bio-industries, biotechnologies
Code ID:1019
Déposé le :13 Décembre 2005

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