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Thèses et Mémoire de l'Université de Strasbourg

Etudes fonctionnelles de TBP et de son paralogue TRF2 in vivo

KIEFFER-KWON, Philippe (2005) Etudes fonctionnelles de TBP et de son paralogue TRF2 in vivo. Thèses de doctorat, Université Louis Pasteur.

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Résumé

L’initiation de la transcription par l’ARN polymérase II requiert la formation d’un complexe multiprotéique sur l’ADN. Ce complexe comprend, outre la pol.II, les facteurs généraux de transcription TFIIA, -B, -D, -E, -F et -H ainsi que le médiateur. TFIID est constitué par la TATA Binding Protéine (TBP) et 13 à 14 facteurs associés (TAFs). TBP participant à la transcription par les trois ARN polymérases nucléaires, Il est souvent considéré comme le facteur « universel ». Le caractère universel de TBP a été remis en cause par la découverte de TRF1, TRF2 et TRF3, des paralogues de TBP. Des études antérieures, dans différents organismes modèles, ont montré que TRF2 est impliqué dans l’embryogenèse et la spermatogenèse. Mais ses fonctions précises sont toujours incertaines. Lors de mes travaux de thèse, j’ai étudié la fonction et la localisation cellulaire de TRF2. Alors que TBP peut être identifié dans tous les compartiments nucléaires, ceci dans toutes les lignées somatiques examinées, TRF2 présente une localisation variable. Dans les cellules HeLa et Cos, ce facteur est concentré dans les nucléoles tout au long du cycle cellulaire. TRF2 est relocalisé dans le nucléoplasme suite à un stress oxydatif et non suite aux traitements apoptotiques ou mitogéniques testés. Un traitement des noyaux par la RNase A ou l’arrêt de la transcription par la pol I provoquent également une relocalisation rapide de TRF2 vers le nucléoplasme. Dans les cellules NIH 3T3, la protéine TRF2 adopte une localisation nucléoplasmique. L’expression constitutive de TRF2 réduit la prolifération et augmente la proportion de cellules en phase S. Nos résultats infirment l’hypothèse d’un passage de TRF2 du cytoplasme au noyau pour réguler la transition G2/M. L’ensemble de nos observations suggère qu’un ou plusieurs ARN(s), probablement du type snoARN, maintient TRF2 dans le nucléole d’où il est libéré lors d’un stress oxydatif. Dans un deuxième projet, nous avons développé un système d’étude in vivo des mutations de TBP. Nous avons généré des fibroblastes murins embryonnaires tbplox/-, dans lesquels TBP peut être invalidé par une activité recombinase Cre. L’absence de TBP s’avère létale pour ces cellules ; elle peut néanmoins être compensée par le TBP humain en transfection transitoire ou stable. Des tests de complémentation ont donc pu être réalisés pour différents mutants du TBP humain, jusqu’alors seulement caractérisés in vitro. La plupart des résidus rapportés comme cruciaux pour l’interaction de TBP avec ses partenaires ne semblent pas nécessaires au maintien de l’intégrité cellulaire. L’expression de certains mutants entraîne toutefois une diminution de la prolifération cellulaire. Ce système offre une nouvelle approche pour mieux comprendre les fonctions de TBP in vivo. The initiation of transcription by RNA polymerase II requires the formation of a multiprotein complex at the basal promoter around the mRNA start site. In addition to polymerase II, this complex comprises the general transcription factors TFIIA, B, D, E, F and H and the mediator complex. TFIID consists of the TATA binding protein, TBP and 13-14 TBP-associated factors, TAFs. TBP has been shown to be involved in transcription by all three nuclear RNA polymerases, however this universal requirement has been called into question by the discovery of the TBP-related factors TRF1, 2 and 3. Previous studies in different model organisms have shown that TRF2 is involved in embryogenesis and in spermatogenesis, but several questions concerning its function remained subject to debate. During my thesis, I have studied the function and intracellular localization of TRF2. These experiments show that TRF2 localises to the nucleolus in HeLa and Cos cells throughout the cell cycle, while TBP is nucleoplasmic and nucleolar. TRF2 is released from the nucleolus by oxidative stress, but not by the other tested apoptotic or mitogenic stimuli. TRF2 is also rapidly released from the nucleolus by arrest of pol I transcription or treatment of the nuclei by RNase A. In contrast, in NIH 3T3 cells, TRF2 is nucleoplasmic indicating that nucleolar localization is cell specific. Constitutive expression of TRF2 in 3T3 cells results in reduced proliferation and an increase the S-phase population. Our results do not support the idea that TRF2 is cytoplasmic and imported into the nucleus to regulate the G2/M checkpoint. Together our results rather suggest that one or several RNAs, perhaps snoRNAs, direct nucleolar localisation of TRF2 where it is released in response to oxidative, but not other stress stimuli. In a second project, we have developed a novel system to evaluate the effect of TBP mutations in vivo. Previous studies have generated a large collection of amino acid substitutions on the surface of TBP. The effect of these mutations has been evaluated in vitro binding assays with its known partners and in vitro transcription assays with pol I, II and III promoters. However, the effect of these mutations has not been studied in vivo in living cells. We have generated tbplox/- mouse embryonic fibroblasts in which TBP can be inactivated by expression of the Cre recombinase. The tbp-/- fibroblasts die rapidly, but the loss of endogenous mouse TBP can be complemented by expression of wild-type human TBP. We have tested the ability of various TBP mutants to complement for the loss of endogenous TBP in either transient or stable expression assays where we have generated viable tbp-/- cell lines expressing mutant TBPs. Our results show that TBP mutants which show severely compromised function in vitro can support cell viability. However, cells expressing several mutants show defective proliferation. This system offers a novel approach to better understand the function of TBP in vivo.

Type d'EPrint:Thèse de doctorat
Sujets:CL Classification > DDC Dewey Decimal Classification > 500 Sciences de la nature et mathématiques > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 572 Biochimie > 572.8 Génétique biochimique
Classification Thèses Unistra > Santé > Sciences de la vie, biologie, biochimie > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 572 Biochimie > 572.8 Génétique biochimique

UNERA Classification UNERA > DISC Discipline UNERA > DISC-16 Sciences de la vie et de la santé, psychologie
UNERA Classification UNERA > ACT Domaine d'activité UNERA > ACT-2 Bio-industries, biotechnologies
Code ID:1075
Déposé le :29 Mai 2006

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