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Thèses et Mémoire de l'Université de Strasbourg

New transgenic mouse models for astrocyte-specific, inducible somatic mutagenesis

ŚLĘZAK, Michał (2007) New transgenic mouse models for astrocyte-specific, inducible somatic mutagenesis. Thèses de doctorat, Université Louis Pasteur.

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Résumé

Les astrocytes sont le type cellulaire le plus représenté dans le cerveau des Mammifères. Ces cellules gliales forment une population hétérogène, différant dans leur morphologie, leur protéome et leurs propriétés physiologiques. Les avancées de la recherche ces dernières décennies ont générées des hypothèses attribuant aux astrocytes un rôle actif dans la formation et le fonctionnement des synapse, la balance énergétique cérébrale, la capture des ions dans le milieu extracellulaire, les processus homéostasiques ou encore la réponse immunitaire dans le système nerveux central. Jusqu’ici la majorité des hypothèses formulées sur leurs fonctions sont basées sur des études in vitro , à cause du manque d’outils permettant de manipuler génétiquement ces cellules in vivo . Le but de ma thèse était d’établir de nouveaux modèles transgéniques murins permettant d’éliminer des gènes d’intérêt spécifiquement dans les astrocytes. Nous avons choisi une approche utilisant le système Cre/loxP qui permet une mutagenèse somatique inductible dans un type cellulaire donné. Le contrôle temporel de la mutagenèse est permis par le recours à une version inductible de la Cre recombinase (CreERT2) par le Tamoxifène (TAM), la protéine Cre restant inactive jusqu’à l’administration de ce ligand synthétique. Nous voulions établir des lignées ciblant différentes sous-populations d’astrocytes, permettant une approche comparative. C’est pourquoi nous avons choisi cinq promoteurs contrôlant l’expression de gènes astrocytaires, à savoir les promoteurs des gènes codant pour le transporteur Glutamate/Aspartate (Glast), la connexine 30 (Cx30), l’aquaporine 4 (Aqp4), l’apolipoprotein E (ApoE) et la glial fibrillary acidic protein (Gfap). Enfin, nous avons opté pour une transgenèse basée sur l’utilisation de chromosomes bactériens artificiels (BAC). Les BACs contiennent de grands fragments d’ADN génomique murin (20-200 kb) insérés dans des bactéries et présentent plusieurs avantages au regard de la transgenèse. Ils peuvent porter la plupart des éléments de régulation de l’expression d’un gène donné, leur intégration dans le génome est moins soumis aux effets de positionnement, et leur utilisation réduit le nombre de lignées qui doivent être dépistées pour identifier celles présentant une forte expression du transgène. Pour générer le transgène, la région entourant le codon ATG (codon initiateur) a été remplacée par la séquence codante CreERT2 dans chaque BAC comportant un gène exprimé dans les astrocytes. Ceci par recombinaison homologue dans des souches bactériennes spécifiquement développées. L’utilisation de différentes enzymes de restriction a permis de vérifier la bonne insertion de la cassette contenant la séquence CreERT2. Les BACs correctement modifiés ont par la suite été purifiés et microinjectés dans des œufs fécondés de souris. Une fois la transgenèse réalisée, deux à cinq lignées fondatrices ont été obtenues pour chaque transgène. Parmi celles-ci, quatre lignées (Glast-CreERT2, Cx30-CreERT2, Aqp4-CreERT2 et ApoE-CreERT2) ont transmis le transgène à leur descendance. Aucune transmission germinale n’a été obtenue pour les lignées Gfap-CreERT2. Par la suite, il nous a fallu déterminer si ces lignées transgéniques permettent de cibler les gènes astrocytaires à l’aide de différentes approches. Tout d’abord, j’ai réalisé des RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) afin de tester si les niveaux de transcrits pour CreERT2 sont comparables au niveau de transcription des gènes endogènes correspondants, dans différentes régions cérébrales et dans les organes périphériques. Dans une des lignées utilisant le promoteur Glast et dans toutes les lignées utilisant le promoteur Cx30, l’expression de CreERT2 correspondait fortement aux niveaux de transcription de Glast et Cx30 respectivement. Pour les autres promoteurs (ApoE et Aqp4) les niveaux d’ARNm codant pour CreERT2 étaient bien plus bas, et montraient une plus faible corrélation avec le niveau de transcrits du gène endogène correspondant. Dans un deuxième temps, nous avons tester l’activité de la recombinase CreERT2 en croisant les différentes lignées avec la lignée « rapporteuse » RXRαaf2/+ qui permet la détection de la recombinaison génique avec une grande sensibilité. Différents protocoles d’injection du Tamoxifen (TAM) ont été appliqués, le plus efficace consistant en une injection journalière de 2 mg de TAM pendant 5 jours consécutifs. Les souris adultes ayant reçues des injections de TAM sont sacrifiées une semaine après la dernière injection. A noter que l’activité de la recombinase détéctée en l’absence de traitement au TAM été tres rare dans les différentes lignées. Dans la lignée Tg(Glast-CreERT2), l’activité recombinase de Cre-ERT2 faisant suite à l’injection de TAM a été observée dans le cervelet, le cortex, l’hippocampe, le mésencéphale, le bulbe olfactif, la médulla et dans les yeux, la rate et la peau. Dans la lignée Tg(Cx30-CreERT2), l’activité recombinase était la plus forte dans le cervelet, le cortex, l’hippocampe, le mésencéphale, le tronc cérébral et la peau. Aucune activité n’a été observée dans les yeux et les autres organes testés. Pour ces deux lignées, le motif de distribution de l’activité de l’enzyme correspond à celui de l’activité du promoteur décrite dans la littérature, et à celui indiqué par nos données de RT-PCR. Dans la lignée Tg(ApoE-CreERT2) l’activité de la recombinase Cre a été observée dans le cervelet, mais est relativement faible ou absente dans les autres régions du cerveau. Une activité recombinase a également été mise en évidence dans le foie. Dans le cas de la lignée Tg (Aqp4-CreERT2), l’activité de Cre s’est révélée être très faible dans le cerveau mais élevée dans le cœur, les reins et les muscles. Ces données sont en accord avec les données publiées sur l’activité des deux promoteurs. Dans le but de déterminer de manière plus précise la distribution de la recombinaison induite par la protéine CreERT2 dans les différentes régions du système nerveux central, les lignées transgéniques ont été croisées avec la lignée rapporteuse Z/AP qui présente la particularité de ne plus exprimer la β-galactosidase (β-gal) après action de Cre, mais exprime l’alcaline phosphatase placentaire humaine (hPLAP), pouvant être visualisée à l’aide de marquage cytochimique trois semaines après la dernière injection de TAM. Dans la lignée Tg(Glast-CreERT2)T45-72 l’activité recombinase a été détectée dans des cellules à morphologie radiaire dans le cervelet, le gyrus denté de l’hippocampe, la paroi du 3ème ventricule et dans la rétine, ainsi que dans certaines cellules à morphologie étoilée dans le cortex, l’hippocampe et l’hypothalamus. Dans la lignée Tg(Cx30-CreERT2)T53-33 l’activité recombinase fut observée dans des cellules radiaires de la matière grise du cervelet et dans de nombreuses cellules étoilées, particulièrement dans le thalamus ou le tronc cérébral, mais aussi dans la matière blanche du cervelet, le cortex et l’hippocampe. Pour les lignées Tg(ApoE-CreERT2) et Tg(Aqp4-CreERT2), très peu de cellules exprimaient hPLAP, indiquant qu’elles ne permettaient pas d’induire une recombinaison génique très étendue dans le cerveau. A ce stade, les résultats obtenus nous ont incités à nous focaliser sur la caractérisation des lignées basées sur les promoteurs Glast et Cx30. Pour confirmer l’identité des cellules dans lesquelles la recombinaison génique a eu lieu, chacune des deux lignées transgéniques a été croisée avec la lignée rapporteuse ROSA26, qui en présence d’activité recombinase Cre va exprimer la β-gal, qui peut être visualisée par marquage immunohistochimique. Ceci présentant l’avantage de pouvoir identifier les cellules exprimant la β-gal à l’aide d’un double marquage en utilisant un second marqueur spécifique. Le marquage sur des coupes de cerveaux d’animaux injectés au TAM a montré que le nombre de cellules présentant une recombinaison est plus important dans cette lignée rapporteuse que dans la lignée Z/AP. Le motif général de distribution de l’activité est en revanche similaire. Pour les deux lignées, la grande majorité des cellules exprimant β-gal était également positive pour l’un des marqueurs astrocytaires GFAP ou S100β, mais pas pour le marqueur neuronal NeuN ou pour le marqueur oligodendrocytaire CNPase. Ceci confirme que les deux lignées Tg(Glast-CreERT2)T45-72 et Tg(Cx30-CreERT2)T53-33 permettent de cibler spécifiquement les astrocytes dans le cerveau adulte. L’efficacité de la recombinaison induite par Cre-ERT2 a été estimée en comptant le nombre de cellules positives pour β-gal et S100β. Dans la lignée Tg(Glast-CreERT2)T45-72 l’expression de β-gal a été observée en moyenne dans 98% des glies de Bergmann positives pour S100β dans le cervelet, 30% des glies de Müller dans la rétine et 20% des astrocytes du cortex et de l’hippocampe. L’activité de Cre-ERT2 a également été mise en évidence dans deux zones de neurogenèse chez l’adulte: la zone sous-ventriculaire et la couche sous-granulaire du gyrus denté. En collaboration avec les Drs C. Goeritz et J. Frisen (Karolinska Institute, Stockholm), nous avons pû confirmer que la lignée Tg(Glast-CreERT2)T45-72 peut être utilisée pour cibler les précurseurs neuronaux dans le cerveau adulte. Dans la lignée Tg(Cx30-CreERT2)T53-33 j’ai déterminé que les cellules exprimant la β-gal représentaient environ 80% des glies de Bergmann, 80% des astrocytes du thalamus, plus de la moitié de ceux du tronc cérébral, et 40% des astrocytes du cortex et de l’hippocampe. Ainsi, mon travail de thèse a abouti à la génération et la caractérisation d’au moins deux lignées de souris transgéniques qui peuvent être utilisées pour inactiver efficacement et de manière inductible des gènes dans les astrocytes. Ces lignées viennent compléter le petit nombre d’animaux transgéniques permettant de cibler ces cellules, et devraient être utiles pour déterminer la fonction des astrocytes dans le cerveau en développement et le cerveau adulte par des approches perte- ou gain-de-fonction.

Type d'EPrint:Thèse de doctorat
Discipline de la thèse / mémoire / rapport :Sciences du vivant. Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Neurosciences
Mots-clés libres:cerveau, astrocytes, mutagénèse somatique inductible, transgénèse
Sujets:CL Classification > DDC Dewey Decimal Classification > 500 Sciences de la nature et mathématiques > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 573 Anatomie, histologie et physiologie animales > 573.8 Système nerveux. Organes des sens
Classification Thèses Unistra > Santé > Sciences de la vie, biologie, biochimie > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 573 Anatomie, histologie et physiologie animales > 573.8 Système nerveux. Organes des sens

CL Classification > DDC Dewey Decimal Classification > 500 Sciences de la nature et mathématiques > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 572 Biochimie > 572.8 Génétique biochimique
Classification Thèses Unistra > Santé > Sciences de la vie, biologie, biochimie > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 572 Biochimie > 572.8 Génétique biochimique

UNERA Classification UNERA > ACT Domaine d'activité UNERA > ACT-5 Santé, industrie du médicament, cosmétique
UNERA Classification UNERA > DISC Discipline UNERA > DISC-16 Sciences de la vie et de la santé, psychologie
Code ID:1364
Déposé le :06 Décembre 2007

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