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Thèses et Mémoire de l'Université de Strasbourg

Cristallogenèse et études structurales appliquées aux aminoacyl-ARNt synthétases

TOUZÉ, ÉLODIE (2007) Cristallogenèse et études structurales appliquées aux aminoacyl-ARNt synthétases. Thèses de doctorat, Université Louis Pasteur.

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Résumé

Les aminoacyl-ARNt synthétases sont des enzymes modulaires responsables de la fixation spécifique des acides aminés sur l’ARNt. De manière générale, chaque cellule comporte 20 aminoacyl-ARNt synthétases, chacune étant spécifique d’un acide aminé. Ces dernières années, plusieurs exceptions ont été observées, notamment l'absence de la glutaminyl-ARNt synthétase (GlnRS) chez de nombreuses bactéries ou archées. Il existe chez ces organismes une voie indirecte d'aminoacylation impliquant une glutamyl-ARNt synthétase (GluRS) non discriminante couplée à une amidotransférase (AdT). Mon travail de thèse concerne principalement les aspects de cristallogenèse et l'étude structurale de la glutaminyl-ARNt synthétase de la bactérie Deinococcus radiodurans (GlnRS-Dr). Si le coeur de cette enzyme est globalement conservée, certaines de ses insertions et extensions la distinguent de ses homologues bactériennes. La plus notable s'étend sur 220 résidus dans le région C-terminale et présente en partie une homologie de séquence avec la sous unité GatB de l'AdT. Des expériences de biochimie ont montré que la suppression cette région entraîne une perte d'affinité pour l'ARNt. La structure cristallographique de la GlnRS-Dr résolue au laboratoire a montré de très faibles variations structurales avec les domaines catalytiques et de liaison à l'anticodon de la GlnRS de E. coli. Néanmoins, la plupart des insertions et surtout l'extrémité C-terminale ne sont pas visibles dans cette structure qui compte 35% de régions mobiles dans le cristal. Afin de caractériser ces régions non visibles, un premier volet de mon travail doctoral a consisté à trouver de nouvelles conditions de cristallisation pour générer un empilement cristallin différent ou à les stabiliser en présence de ces différents substrats. Plusieurs conditions ont permis l’obtention de cristaux de la forme native ou complexée (glutamine, ou Gln, analogues de glutaminyl-adénylate, ARNtGln sous forme de transcrit). Les structures de la GlnRS co-cristallisée avec la glutamine, deux analogues d'adénylate (glutaminol et glutaminyl-sulfamoyl adénylates), et de la GlnRS tronquée de son domaine additionnel C-terminal (GlnRS-ΔC) ont été résolues entre 1,9 à 2,5 Å. Ces résultats ont permis de caractériser les variations structurales du site actif induites par la présence des substrats et de comparer leur mode de fixation avec les données disponibles. L’architecture globale de l’enzyme en présence d’adénylates est proche de l’enzyme libre. La résolution de la structure 3D de la GlnRS cocristallisée avec la Gln et la GlnRS-ΔC a permis de résoudre une longue boucle qui verrouille le site actif. Celle-ci n'existe que dans 2 espèces du genre Deinococcus. En revanche, aucune des nouvelles structures ne permet de visualiser l'extrémité C-terminale. Une autre approche de mon travail concerne l’étude de la géométrie de l'empilement cristallin de la GlnRS-Dr. En présence de petits substrats, on observe, pour un même groupe d’espace, une augmentation jusqu’à 14% du volume de la maille, révélant la plasticité de cet empilement. Il en résulte une diminution notable des contacts intermoléculaires ainsi qu'un élargissement des canaux de solvant. Ces derniers sont suffisamment importants pour accommoder une extrémité C-terminale structurée mais mobile, que ce soit en présence ou en absence de substrat. Pour compléter cette étude, une analyse structurale en solution par résonance magnétique nucléaire (RMN) a été entreprise sur l’extrémité C-terminale isolée (YqeY-λ) et suggère la présence d'une région majoritairement structurée. Les expériences complémentaires de RMN en deux dimensions sur la partie YqeY-λ marquée en 15N l'ont confirmé. Des mesures en dichroïsme circulaire nous ont également informés sur la composition en structures secondaires de ce module. Enfin, en parallèle de mon projet doctoral principal, j'ai mis à profit les compétences acquises en cristallographie en participant à l'étude structurale d'une autre synthétase. Ce travail a conduit à la détermination de la première structure tridimensionnelle d'une synthétase humaine d'origine mitochondriale : la Tyrosyl-ARNt synthétase (mt-TyrRS). La structure correspond à un complexe d'analogue de substrat qui ressemble globalement à celle des autres TyrRS mais montre plusieurs caractéristiques mitochondriales qui les en distingue.

Type d'EPrint:Thèse de doctorat
Discipline de la thèse / mémoire / rapport :Sciences du vivant. Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Mots-clés libres:aminoacyl-ARNt synthétases, cristallogenèse
Sujets:UNERA Classification UNERA > ACT Domaine d'activité UNERA > ACT-5 Santé, industrie du médicament, cosmétique
CL Classification > DDC Dewey Decimal Classification > 500 Sciences de la nature et mathématiques > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 572 Biochimie > 572.7 Enzymes
Classification Thèses Unistra > Santé > Sciences de la vie, biologie, biochimie > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 572 Biochimie > 572.7 Enzymes

UNERA Classification UNERA > DISC Discipline UNERA > DISC-16 Sciences de la vie et de la santé, psychologie
Code ID:1440
Déposé le :07 Avril 2008

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