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Thèses et Mémoire de l'Université de Strasbourg

Ingénierie d'une protéase monospécifique pour le diagnostic du glucose sanguin

CIREFICE, Morgane (2009) Ingénierie d'une protéase monospécifique pour le diagnostic du glucose sanguin. Thèses de doctorat, Université de Strasbourg.

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Résumé

Le dosage sanguin de la glycémie via le taux d´hémoglobine glyquée (HbA1c) est un paramètre-clé de la surveillance du diabète à long terme. Roche Diagnostics GmbH s´est engagé avec la Fédération Internationale de Chimie Clinique et de Médecine de Laboratoire (IFCC) à développer un système standard de référence international de contrôle de la glycémie. L´endopeptidase glutamique (GluC) de la souche V8 de Staphylococus aureus (EC 3.4.21.19) est utilisée pour la digestion de l´HbA1c. L´objectif de cette thèse de doctorat est d´augmenter la vitesse d´hydrolyse de la GluC par évolution moléculaire tout en préservant ses caractéristiques enzymatiques originelles (spécificité et stabilité) dans les conditions standardisées du test fonctionnel de l´HbA1c. La construction de librairies de plusieurs milliers de variants, couplée à un criblage multiparamètre, a permis d’isoler un mutant de la GluC qui comporte les propriétés recherchées. Ce variant a été exprimé chez B. subtilis par sécrétion extracellulaire et purifié par chromatographie d’affinité Ni-NTA. Il a été ensuite caractérisé après activation par autoprotéolyse. Le variant présente une activité spécifique 3 fois supérieure et une constante d’affinité (Km) trois fois meilleure à celle de la GluC sauvage pour le substrat synthétique: Z-Phe-Leu-Glu-pNa dans un tampon de Tris-HCl à pH 7.8. Le variant est 4 fois plus actif dans un tampon d´acétate d´ammonium à pH 4.3 avec l´hexapeptide de l´hémoglobine pour substrat. Il est également plus stable à 50°C. Bien que plus actif que la GluC sauvage en présence de substrats synthétiques, le variant isolé est moins performant d’un point de vue activité, affinité et spécificité de coupure pour l´hexapeptide de l´hémoglobine entière.

Type d'EPrint:Thèse de doctorat
Discipline de la thèse / mémoire / rapport :Sciences du vivant
Mots-clés libres:diabète ; endopeptidase glutamique V8 (EC 3.4.21.19) ; hémoglobine glyquée (HbA1c) ; surveillance à long terme du glucose sanguin ; évolution moléculaire ; expression recombinante chez B. subtilis ; système de criblage à haut-débit multiparamètre ; activité enzymatique ; affinité (Km) ; thermostabilité ; spécificité de clivage
Sujets:CL Classification > DDC Dewey Decimal Classification > 500 Sciences de la nature et mathématiques > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 572 Biochimie > 572.8 Génétique biochimique
Classification Thèses Unistra > Santé > Sciences de la vie, biologie, biochimie > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 572 Biochimie > 572.8 Génétique biochimique

UNERA Classification UNERA > ACT Domaine d'activité UNERA > ACT-5 Santé, industrie du médicament, cosmétique
CL Classification > DDC Dewey Decimal Classification > 600 Technologie (sciences appliquées) > 610 Médecine et santé > 616 Maladies > 616.4 Maladies des systèmes glandulaire et endocrinien
Classification Thèses Unistra > Santé > Médecine et odontologie > 610 Médecine et santé > 616 Maladies > 616.4 Maladies des systèmes glandulaire et endocrinien

CL Classification > DDC Dewey Decimal Classification > 500 Sciences de la nature et mathématiques > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 572 Biochimie > 572.7 Enzymes
Classification Thèses Unistra > Santé > Sciences de la vie, biologie, biochimie > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 572 Biochimie > 572.7 Enzymes

UNERA Classification UNERA > DISC Discipline UNERA > DISC-16 Sciences de la vie et de la santé, psychologie
Code ID:1725
Déposé le :17 Février 2010

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