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Thèses et Mémoire de l'Université de Strasbourg

La rétrotranscription de HIV-1 : étude du complexe d’initiation et des mécanismes de résistance aux inhibiteurs nucléosidiques

GOLDSCHMIDT, Valérie (2004) La rétrotranscription de HIV-1 : étude du complexe d’initiation et des mécanismes de résistance aux inhibiteurs nucléosidiques. Thèses de doctorat, Université Louis Pasteur.

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Résumé

La rétrotranscription est une étape centrale du cycle réplicatif de HIV-1 et permet la synthèse de l’ADN proviral bicaténaire à partir de l’ARN génomique. Elle requiert la présence de trois partenaires : l’ARN viral (ARNv) qui sert de matrice, l’ARNt3Lys cellulaire qui sert d’amorce, et la rétrotranscriptase virale (RT). Les 18 nucléotides 3’-terminaux de l’ARNt3Lys sont strictement complémentaires d’une séquence appelée PBS (Primer Binding Site) où débute la rétrotranscription. Notre laboratoire a démontré qu’outre cette interaction, des remaniements conformationnels intra- et intermoléculaires ont lieu lors de la formation du complexe ARNt3Lys/ARNv de l’isolat MAL de HIV-1, dont la région PBS dérive du sous type A. Des études de cartographie en solution et d’empreinte de la RT ont permis d’élaborer un modèle tridimensionnel du complexe ARNt3Lys/ARNv : RT. Il suggère que la RT interagit avec l’hélice intermoléculaire du PBS, les trois premiers nucléotides de la matrice en simple brin en amont du PBS, ainsi que les trois hélices intramoléculaires formées par l’ARNv. Nous avons dans un premier temps identifié les éléments structuraux du complexe d’initiation de l’isolat MAL de HIV-1 cruciaux pour l’initiation de la rétrotranscription. Nos résultats montrent le rôle essentiel de la structure tridimensionnelle globale dans le processus d’initiation. Puis, nous avons entrepris une étude structurale (in vitro et in situ) et fonctionnelle comparative de deux isolats, MAL et Hxb2/NL4-3, dont les domaines PBS appartiennent respectivement aux sous-types A et B. Cette étude a montré la versatilité du système HIV-1. Contrairement à la situation observée avec l’isolat MAL, l’interaction entre le PBS de l’ARNv de l’isolat Hxb2/NL4-3 et les 18 nucléotides 3’-terminaux de l’ARNt3Lys est suffisante pour initier la reverse transcription, en absence de tout remaniement conformationnel. En particulier, l'interaction entre la séquence riche en A de l'ARNv et l'anticodon de l’ARNt3Lys, cruciale dans le cas de l'isolat MAL, n’est pas requise pour une initiation efficace de la rétrotranscription. Ces différences s’expliquent par les différentes structures adoptées par les ARN viraux avant l’hybridation à l’ARNt3Lys, pouvant avoir un effet négatif. Nous avons mené une étude structurale et fonctionnelle de virus mutants, obtenus par C. Morrow, capables de se répliquer en utilisant une amorce non naturelle, l’ARNtHis. Dans ce cas précis, la structure adoptée par l’ARNt après son hybridation à l’ARNv devient un facteur négatif, contré par l’apparition d’une interaction stable entre l’anticodon de l’ARNt et l’ARNv. Il existe une bonne corrélation entre la stabilité de cette interaction intermoléculaire et l’initiation de la rétrotranscription. Cette interaction est renforcée par l’apparition de mutations additionnelles stabilisant le virus en culture cellulaire. Lors du traitement par l’AZT, de nombreuses mutations de résistance apparaissent. Les paramètres cinétiques des mécanismes d’enlèvement par ATP-lyse et pyrophosphorolyse en présence des RT sauvage et résistante ont été déterminés au laboratoire. Bien que les mutations de résistance permettent une réparation par ATP-lyse, la RT sauvage présente une résistance innée via le mécanisme de pyrophosphorolyse, dont l’efficacité d’enlèvement est supérieure à celle obtenue par ATP-lyse en présence de l’enzyme résistante. Nous avons étudié l’influence de la concentration en Mg2+ libre sur les activités catalytiques de la RT de HIV-1. La concentration en Mg2+ libre influence les activités RNase H et polymérase, en agissant sur l’incorporation de nt et la processivité de l’enzyme, ainsi que la stabilité de la matrice ARN. De plus, l’inhibition de la synthèse d’ADN par un terminateur de chaîne est dépendante de la concentration en Mg2+. L’inhibition est levée, non pas par un mécanisme d’excision des NRTI incorporés, mais par un mécanisme de discrimination Mg2+ dépendant.

Type d'EPrint:Thèse de doctorat
Mots-clés libres:rétrovirus – HIV – rétrotranscription – ARNt amorce - structure – initiation – résistance – inhibiteur - Mg2+
Sujets:CL Classification > DDC Dewey Decimal Classification > 500 Sciences de la nature et mathématiques > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 579 Micro-organismes, champignons, algues > 579.2 Virus
Classification Thèses Unistra > Santé > Sciences de la vie, biologie, biochimie > 570 Sciences de la vie. Biologie. Biochimie > 579 Micro-organismes, champignons, algues > 579.2 Virus

UNERA Classification UNERA > ACT Domaine d'activité UNERA > ACT-5 Santé, industrie du médicament, cosmétique
UNERA Classification UNERA > DISC Discipline UNERA > DISC-16 Sciences de la vie et de la santé, psychologie
Code ID:931
Déposé le :05 Avril 2005

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